В вашей корзине: 0 тов.
оформить | очистить
Отдел сбыта: +7 (8453) 76-35-48
+7 (8453) 76-35-49
Не определен

Тема 8. Генная инженерия: ее развитие и методы

В начале 70-х гг. ХХ в. успехи в познании структуры и механизма действия гена привели к развитию нового направления молекулярно-генетических исследований — генной инженерии. Целью этого направления является генетическое конструирование, т.е. создание клеток и организмов с заранее запланированными свойствами. Развитие генной инженерии стало возможным благодаря тому, что генетики научились получать отдельные гены. Именно этот прогресс породил идею о манипулировании ими. Впервые ген, а точнее лактозный оперон, был выделен из клетки E. coli в лаборатории американского ученого Дж. Бэквита в 1969 г. Для этого было использовано явление трансдукции (см. предыдущую лекцию). Клетки кишечной палочки инфицировали двумя трансдуцирующими фагами: λ и φ-80, которые очень близки по структуре генома. Оба фага при трансдукции включают в свой состав lac-оперон, но в противоположной ориентации по отношению к собственному геному. Это соответствует сайтам интеграции этих фагов на  противоположных концах оперона. У обоих фагов одна цепь ДНК отличается от другой по плавучей плотности.

Схема выделения lac-оперона

Схема выделения lac-оперона

После освобождения фаговых частиц из клетки их  ДНК подвергали плавлению (т.е. разделяли на одиночные цепи), а потом разделяли на тяжелые и легкие цепи с помощью центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Затем тяжелые цепи двух разных фагов подвергали молекулярной гибридизации. Благодаря противоположной ориентации комплементарное спаривание осуществлялось только в участке lac-оперона, а участки генома фагов оставались неспаренными. Их удаляли с помощью фермента нуклеазы, специфично действующей на однонитиевую ДНК. Таким образом был получен в чистом виде участок ДНК, соответствующий лактозному оперону E. coli. Эксперимент Дж. Беквита принято считать началом генной инженерии.

Вслед за выделением гена из клетки в том же году был впервые осуществлен химический синтез гена. Руководитель коллектива, выполнившего эту работу, Г. Корана (США) стал в 1968 г. лауреатом Нобелевской премии. Его группе удалось синтезировать ген аланиновой т-РНК дрожжей, структура которой к тому времени была полностью расшифрована американским биохимиком Р. Холли в 1965 г. (Нобелевская премия 1968 г.). Ген состоит из 77 нуклеотидов. Сначала из отдельных нуклеотидов химическим путем синтезировали короткие фрагменты длиной в 8-12 нуклеотидов (олигонуклеотиды). Затем осуществлялась ферментативная сшивка (ферментом лигазой) этих коротких фрагментов ДНК с липкими (однонитиевыми) концами. Таким образом Коране удалось заново создать молекулу ДНК по заранее намеченному плану в соответствии с описанной Р. Холли нуклеотидной последовательностью тРНК. Работу группы Кораны по трудоемкости образно сравнили со строительством египетских пирамид. Она продолжалась 10 лет. Однако были синтезированы только структурные части гена, и поэтому ген не способен был работать. Позже, продолжая работу в этом направлении, группа смогла синтезировать отрезок ДНК E. coli, содержащий ген тирозиновой тРНК длиной в 126 п.н., к которому были затем присоединены промотор (52 п.н.) и терминатор (21 п.н.). Этот искусственно синтезированный ген оказался работоспособным.

Путь прямого синтеза гена из составляющих его нуклеотидов оказался долгим и трудоемким. Гораздо больше перспектив открыл способ получения генов методом обратной транскрипции. Обратная транскрипция — это синтез ДНК на РНК.

В 1970 г. схема, отражающая направление потока генетической информации в клетке, была существенно дополнена. Был обнаружен особый фермент ДНК-полимераза, который в качестве матрицы для синтеза ДНК использует не ДНК, а РНК. После выделения этого фермента, получившего название обратной транскриптазы, сразу в трех лабораториях США были синтезированы гены, кодирующие структуру гемоглобина человека и животных (работы Г. Темина, Д. Балтимора  и др.). В дальнейшем было установлено, что обратная транскрипция является обычным явлением при размножении вирусов, геном которых представлен не ДНК, а РНК. Эти вирусы получили название ретровирусов.

Жизненный цикл ретровирусов выглядит следующим образом. Заражая клетку, вирус вносит в нее свой геном, представленный одноцепочечной РНК, в составе которого имеется ген, кодирующий фермент обратную транскриптазу. С помощью этого фермента и ДНК-полимеразы клетки-хозяина вирусная РНК транскрибируется в двуцепочечную молекулу ДНК. Транскрипт интегрируется с хромосомой клетки-хозяина и реплицируется вместе с ней как часть генома. Затем с этой ДНК идет транскрипция вирусной иРНК и трансляция ее с образованием вирусных белков, которые обусловливают перерождение клетки в опухолевую. В процессе вегетативного роста вируса РНК упаковывается в капсулу и образуются новые вирусные частицы.

Способность обратной транскриптазы вести синтез ДНК на РНК in vitro открыла путь для широкого использования явления обратной транскрипции с целью получения генов. Вскоре они были получены у разных объектов: человека, кролика, мыши, голубя, вирусов.

Однако основным успехом в области получения изолированных генов стало использование специфических ферментов — рестриктаз, способных разрезать молекулу ДНК на фрагменты. Еще в начале 60-х гг. ХХ в. В. Арбером (швейц. генетик) были обнаружены ферменты, естественной функцией которых является защита бактериальной клетки от чужеродной (в основном вирусной) ДНК путем ее деградации. При этом на собственную ДНК эти ферменты не действуют, т.к. в сайтах рестрикции ДНК модифицирована метилированием, которое защищает ее от деградации.

Первая рестриктаза, специфично расщепляющая двуцепочечную молекулу ДНК в определенных сайтах, была выделена Х. Смитом и его коллегами в 1970 г. из штамма Haemophilus influenzae. Она названа HindIII. В настоящее время известно более 400 рестриктаз.

С помощью рестриктаз ДНК разрезают на фрагменты. Многие рестриктазы, подобно HindIII, являются сайтспецифическими, т.е имеют места узнавания на хромосоме, которые чаще всего представлены повторами. Для генной инженерии важно, чтобы рестриктазы, разрезая ДНК, оставляли липкие (т.е. однонитиевые) концы, способные к комплементарному спариванию. Если рестриктаза при разрезании не оставляет липких концов, то их искусственно наращивают с помощью специфических ферментов трансфераз. Примером рестриктаз, образующих “липкие концы”, являются широко используемые в генной инженерии рестриктазы EcoRI и BamHI. Первая контролируется R-плазмидой E. coli, вторая обнаружена в клетках Bacillus amyloliquefaciens.

Для введения полученных фрагментов в клетки используют молекулы-переносчики, или векторы. В качестве векторов выступают молекулы ДНК, обладающие способностью к переходу из клетки в клетку. Это свойство носит название “трансмиссии”. Им обладают плазмиды, вирусы, бактериофаги и транспозоны. Идеальный вектор должен отвечать следующим требованиям:

1) содержать минимальное количество ДНК;
2) автономно реплицироваться;
3) иметь в составе маркерные гены;
4) обладать одним сайтом рестрикции.

Первый вектор был создан в 1974 г. на основе фага λ. При соединении его с фрагментом необязательная часть генома фага (у фага λ она составляет ~ 1/3 часть генома) замещается вводимым геном (или генами).

Широко используются векторы, созданные на основе R-плазмид, содержащих гены устойчивости к антибиотикам, и Е-плазмид, определяющих синтез колицинов. Так, бактериальный вектор pBR322 получен на основе небольшой плазмиды ColEI и несет гены устойчивости к ампицилину (Apr) и тетрациклину (Tcr) с единственным сайтом рестрикции в гене . При определенных условиях культивирования можно добиться избирательной амплификации этой плазмиды с образованием до тысячи копий на клетку.

Схема встраивания фрагмента ДНК в плазмиду pBR322

Схема встраивания фрагмента ДНК в плазмиду pBR322

Для переноса генов используют также космиды — гибридные векторы, состоящие из плазмиды и ДНК фага l, содержащей специфический участок (cos-сайт), отвечающий за упаковку ДНК в белковую капсулу. Плазмида, в свою очередь, содержит маркерные гены, сайт репликации и сайт рестрикции. Такие векторы являются более эффективными, чем обычные плазмидные.

Среди большого разнообразия векторов есть челночные векторы, которые способны реплицироваться в двух и более организмах-хозяевах. Для каждого хозяина в плазмиде есть свой сайт репликации (ori).

В генной инженерии растений используются векторы, созданные на основе Ti-плазмиды Agrobacterium tumenfaciens. Для трансформации клеток человека приспособлен онкогенный вирус SV-40 (аденовирус, или обезьяний вирус).

Космидный вектор

Космидный вектор

Имеющийся вектор сшивают с фрагментом ДНК, содержащим нужный ген (или гены), и получают так называемые рекомбинантные молекулы. Для сшивания используют ферменты лигазы. Полученные рекомбинантные ДНК тем или иным способом вводят в клетку. Процесс внесения в геном чужеродных генов называется трансгенезом.

При использовании для получения фрагментов ДНК рестриктаз, не обладающих сайтспецифичностью, приходится иметь дело с фрагментами, генный состав которых заранее не известен. В этом случае поступают обычно так: ДНК дробят рестриктазами на множество фрагментов и вслепую сшивают их с векторами. Полученные рекомбинантные молекулы вводят в клетки кишечной палочки. Затем начинают отбор клеток с нужным геном с помощью селективных сред. Допустим, что нужен ген устойчивости к тетрациклину. Тогда бактерии высевают на среду с этим антибиотиком. Клетки, в которые этот ген не попал, погибают. Выжившие клетки размножают; введенный в них ген будет реплицироваться вместе с вектором, и таким образом осуществляют клонирование введенных молекул ДНК.

Для идентификации фрагментов используют также метод молекулярной гибридизации фрагмента с иРНК, соответствующей нужному гену.

Использование сайтспецифических рестриктаз, а также получение гена методом обратной транскрипции упрощают или полностью исключают процедуру идентификации фрагментов.

Схема выявления плазмид, содержащих встройку клонируемых фрагментов ДНК

Схема выявления плазмид, содержащих встройку клонируемых фрагментов ДНК

Перенос генов в пределах одного типа клеток (прокариотического или эукариотического) называется гомологическим переносом. Он осуществляется легче, чем гетерологический перенос, когда бактериальные гены вносятся в эукариотическую клетку, или наоборот. В качестве одного из первых примеров гомологического переноса можно привести введение в клетку E. coli рекомбинантной молекулы, содержащей плазмидный вектор и два бактериальных гена — ген устойчивости к тетрациклину и ген устойчивости к стрептомицину. В результате клетка приобрела устойчивость к обоим антибиотикам. В другом эксперименте в клетку кишечной палочки были введены гены, отвечающие за фиксацию атмосферного азота, взятые из клебсиеллы (азотофиксирующая бактерия), и E. coli приобрела способность к усвоению азота из воздуха.

Гетерологический перенос генов более труден. Гены эукариот обычно не экспрессируются в прокариотических клетках, что обусловлено различиями в структурной организации и механизме регуляции экспрессии этих генов. Для достижения положительного результата в настоящее время при создании рекомбинантных молекул используются специальные технологии. Тем не менее, еще в 1974 г. была доказана транскрипция рибосомальных генов лягушки (Xenopus laevis L.) в клетках E. coli (эксперимент Дж. Морроу). Вслед за этим в клетку E. coli были введены гены дрозофилы, мыши, человека.

Один из первых экспериментов по переносу бактериальных генов в эукариотические клетки осуществлен американским ученым Г. Финком. Используя рекомбинантную плазмиду, он ввел в дрожжевые клетки, ауксотрофные по лейцину, бактериальный ген leu+. Ген встроился в хромосому дрожжей, превратив клетки в прототрофные. Широко известны опыты другого американского ученого П. Меррила, который в 1971 г. осуществил перенос с помощью фага λ галактозного гена кишечной палочки в культуру клеток человека, больного галактоземией (тяжелое расстройство углеводного обмена, приводящее к идиотии). Введение гена, кодирующего структуру недостающего фермента, необходимого для усвоения галактозы, восстановило нормальное функционирование клеток. В 1977 г. М. Виглер с коллегами получили трансформированные клетки мыши in vitro путем введения в среду ДНК, содержащую ген, кодирующий фермент тимидинкиназу вируса герпеса.

Одним из наиболее ощутимых результатов генной инженерии стало создание бактерий-суперпродуцентов биологически активных веществ. С помощью плазмидных векторов в клетки E. coli вводят ген, кодирующий структуру какого-либо важного вещества, например триптофана. Клетку обрабатывают хлорамфениколом — веществом, препятствующим делению, но не подавляющим репликацию плазмиды. Благодаря этому плазмида многократно копируется вместе с введенным в нее геном, и клетка в больших количествах синтезирует триптофан, превращаясь в фабрику синтеза этого продукта. Подобные эксперименты привели, в конечном итоге, к развитию биотехнологии — промышленного производства биологически активных веществ на основе методов генной инженерии. Разработка методики введения в бактериальную клетку эукариотических генов позволила осуществить промышленный синтез таких необходимых человеку препаратов, как инсулин, соматостатин, факторы крови, интерферон и др.

Схема получения фактора крови человека

Схема получения фактора крови человека

На схеме представлена процедура получения белкового фактора крови человека. Из клеток печени экстрагируется мРНК. На ней методом обратной транскрипции получают кДНК. Ее сшивают с вектором, способным интегрироваться на бактериальной хромосоме. Обнаруживают кДНК в составе бактериального генома с помощью молекулярного зонда — короткого меченого фрагмента ДНК, комплементарного участку кДНК. Трансформированные клетки размножают. Затем из них выделяют кДНК и в составе автономно реплицирующейся плазмиды вводят в клетку E. coli. Деление клетки подавляют хлорамфениколом, и она становится фабрикой синтеза белка, контролируемого геном кДНК, многократно копированным в ходе автономной репликации плазмиды.

Большой прогресс достигнут в области генной инженерии растений. Наиболее распространенным методом трансформации, в первую очередь у двудольных растений, является использование бактерий рода Agrobacterium (в частности, A. tumenfaciens). Эти почвенные бактерии вызывают у растений развитие опухолей, секретирующих особые вещества — опины (производные аргинина), которые служат для питания бактерий. Удалось выделить фактор, отвечающий за инфекционность, — Ti-плазмиду (мегаплазмида размером 200 тыс. п.н.). В ее составе оказался сходный с транспозоном элемент, который вносился в геном растительных клеток при инфекции. Эта часть плазмиды называется Т-ДНК. В ее переносе в клетку и встраивании в геном принимают участие как гены расположенные в самой плазмиде,  так и ряд генов бактериальной хромосомы. На основе Т-ДНК Ti-плазмиды созданы так называемые обезоруженные векторы, из которых удалены гены, вызывающие развитие опухоли. В таком виде этот вектор становится практически безвредным для растений.

Ti-плазмида

Ti-плазмида: Т-область — ДНК плазмиды, переносимая в ядро клетки растения; LB и RB — левая и правая границы Т-области; AUX и CYT — гены, контролирующие синтез ауксина и цитокинина в трансформированной клетке и инициирующие рост опухолевых клеток; NOS — ген, контролирующий синтез иопалина (источника углерода, азота и энергии в трансформированной клетке); VIR, CON и ORI — область вирулентности, конъюгации и независимой репликации.

Для введения генов с использованием Т-ДНК A. tumenfaciens использовались различные методы. Например, протопласты табака обрабатывались препаратом Т-ДНК в присутствии полиэтиленгликоля и ДНК тимуса теленка, в результате чего были получены трансформированные линии.

Для лучшего проникновения Т-ДНК в клетку используют метод электропорации — обработку импульсным током высокого напряжения, в результате которой в клеточной мембране образуются поры.

Очень эффективен, но трудоемок метод микроинъекции ДНК в растительные клетки. Таким методом вводили ДНК в клетки эмбриоидов табака, люцерны, рапса.

В последнее время наиболее популярен метод прямого переноса с использованием установки “short gun” (метод дробовика). Это так называемая баллистическая трансформация. Ее суть в том, что на частички металла (вольфрама или золота) осаждается ДНК, и они разгоняются в установках с использованием электрического разряда или гелия и направляются на растительные клетки. Затем производится тестирование активности введенных генов. О конкретных результатах получения трансгенных растений мы расскажем в лекции, посвященной генетическим основам селекции.

Опыты по созданию трансгенных животных были начаты в середине 70-х гг. В них использовался метод инъекции чужеродной ДНК в клетки эмбрионов различных млекопитающих, растущих в культуре in vitro, а позже in situ. Основным объектом в этих экспериментах были лабораторные линии мышей, хотя подобные опыты проводились также на шпорцевой лягушке, дрозофиле, кроликах и др.

У животных процедура трансгенеза выглядит следующим образом. Из организма матери берут только что оплодотворенную яйцеклетку и инъецируют в ее ядро небольшое количество ДНК с нужным геном. Затем яйцеклетку имплантируют в матку. При благоприятном исходе процедуры ген встраивается в геном реципиента. Чаще всего экспрессии гена все же не наблюдается. Но в исключительных случаях может наблюдаться положительный результат.

Впервые трансформация всего организма путем инъекции копий генов млекопитающих в оплодотворенное яйцо мыши была осуществлена в 1981 г. Е. Вагнером и др. Ген b-гемоглобина кролика в количестве 20 000 копий вводился в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйца после инъекции культивировали в искусственной питательной среде до стадии бластоцисты, а затем реимплантировали в матку матери. Из 46 мышей, полученных из реимплантированных эмбрионов, пять имели в эритроцитах гемоглобин кролика. Ген передавался потомству, т.к. был интегрирован с ДНК мыши.

Один из сенсационных случаев — получение линии гигантских мышей, получивших ген гормона роста крысы, который экспрессировался. Работа была выполнена в 1982 г. Р. Палмиттером и коллегами. Фрагмент ДНК, содержащий промотор одного из генов мыши и ген гормона роста крысы, был встроен в плазмиду и в количестве 600 копий инъецирован в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши. Часть потомства, полученного из инъецированных яйцеклеток, проявляла явные признаки гигантизма. Наличие в их клетках введенного фрагмента установлено методом молекулярной гибридизации.

Для достижения нормальной работы вводимого эукариотического гена необходимо присутствие в составе рекомбинантной молекулы специфического регуляторного участка — энхансера, разрешающего экспрессию интегрированного гена.

Гигантские мыши

Гигантские мыши

С самого рождения генной инженерии ее сопровождал повышенный интерес со стороны не только биологов, но и ученых других специальностей. Непредсказуемость поведения клеток после введения в них рекомбинантных молекул ставила вопрос о степени опасности подобных экспериментов. Он стал предметом оживленной дискуссии на международном симпозиуме в 1975 г. в Асиломаре (США). В США была создана комиссия по контролю за экспериментами в области генной инженерии, которая выработала правила работы с рекомбинантными молекулами. Ряд ученых, в том числе Дж. Уотсон, предлагали объявить добровольный мораторий на исследования в области генной инженерии. Однако это означало бы отказ от управления наследственностью во благо человека. По мнению академика В.А. Энгельгардта, “… главная угроза заключается не в самих опытах, как таковых, а в том, чтобы они не стали предметом оперирования в руках людей легкомысленных и беспечных, или же в руках злонамеренных элементов”. Социальные последствия генно-инженерных опытов и сейчас волнуют людей в связи с использованием в качестве продуктов питания трансгенных растений и в связи с предполагаемым введением генетической паспортизации. Этих аспектов мы коснемся в следующих лекциях, посвященных генетике человека и селекции.

 


Читайте также: Селекция и генная инженерия. Трансгенные растения

 Вопросы и задания по теме "Генная инженерия"

Похожий материал:

Лекция 25. Селекция микроорганизмов. Биотехнология

Перейти к чтению других тем книги "Генетика и селекция. Теория. Задания. Ответы":